單細(xì)胞測(cè)序( Single-Cell Sequencing) 無(wú)疑是2019生物領(lǐng)域最火的熱點(diǎn)之一，應(yīng)用這一技術(shù)發(fā)表的文章越來(lái)越多，截止目前，國(guó)內(nèi)科學(xué)家已經(jīng)發(fā)表了107篇高分文章，涉及到的物種有人類(lèi)，小鼠，果蠅，斑馬魚(yú)，鹿，扇貝，擬南芥，擬蘭，棉花，罌粟等等；關(guān)于單細(xì)胞研究的組織類(lèi)型有胚胎，腦，視網(wǎng)膜，心臟，胰腺，前列腺，胃，脂肪，骨髓等等......在這百余篇高分文章中，有90篇是在2019年發(fā)表的，期待2020年的單細(xì)胞文章大爆發(fā)！

今天我們就詳細(xì)的講解一下單細(xì)胞測(cè)序神器。

研究背景

隨著生物學(xué)的不斷發(fā)展，細(xì)胞群體的研究已不再能滿足科研需求；單細(xì)胞測(cè)序解決了用組織樣本測(cè)序或樣本少時(shí)無(wú)法解決的異質(zhì)性難題，為科學(xué)家解析單個(gè)細(xì)胞的行為、機(jī)制、與機(jī)體的關(guān)系提供了新方向，單細(xì)胞測(cè)序已逐漸成為科研熱點(diǎn)。

單細(xì)胞測(cè)序即從單個(gè)細(xì)胞水平上對(duì)基因組或轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測(cè)序分析的一項(xiàng)新技術(shù)。與傳統(tǒng)高通量測(cè)序相比，單細(xì)胞測(cè)序不僅能夠分析相同表型細(xì)胞的異質(zhì)性，還能獲取難以培養(yǎng)微生物的遺傳信息以及珍貴的臨床樣本的信息，具有廣闊的應(yīng)用前景。

把基因測(cè)序應(yīng)用到單個(gè)細(xì)胞層面，對(duì)于識(shí)別細(xì)胞的類(lèi)型、功能，特定細(xì)胞健康或狀態(tài)的變化、變異至關(guān)重要，已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)，種系傳播，器官生長(zhǎng)，癌癥生物學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。 

10x Chromium Controller

單細(xì)胞水平的高通量基因表達(dá)譜分析，對(duì)復(fù)雜細(xì)胞群體深入分析，表征單個(gè)細(xì)胞的表達(dá)譜。可同時(shí)檢測(cè)CRISPR干擾、細(xì)胞表面蛋白，避免單個(gè)細(xì)胞的異質(zhì)性生物學(xué)信息被大量細(xì)胞的均質(zhì)化掩蓋。

10x Genomics 3'單細(xì)胞表達(dá)譜分析，通過(guò)微流體芯片將單個(gè)細(xì)胞分配到單個(gè)油包水液滴中，進(jìn)行反應(yīng)。同時(shí)可以獲得 100-10000個(gè)細(xì)胞的表達(dá)信息，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞群體的劃分與細(xì)胞群體間基因表達(dá)差異的檢測(cè)，是腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性、免疫細(xì)胞群體檢測(cè)以及胚胎發(fā)育研究的黃金方法。

基于Feature Barcoding技術(shù)，可檢測(cè)細(xì)胞表面蛋白，能同時(shí)評(píng)估mRNA和蛋白表達(dá)譜的差異，獲得更詳細(xì)的細(xì)胞表型特征。

技術(shù)原理

10x Genomics儀器小巧，但功能強(qiáng)大，具有通量高、靈活性強(qiáng)、流程簡(jiǎn)單、技術(shù)性能高、單個(gè)細(xì)胞制備成本低等優(yōu)勢(shì)，其技術(shù)核心是油滴包裹的凝膠珠（GEM），該系統(tǒng)有數(shù)百萬(wàn)種barcoded bead。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)

通量高，一次可以同時(shí)測(cè)8個(gè)樣本；

每個(gè)樣本可測(cè)10000個(gè)細(xì)胞；周期短，

18分鐘內(nèi)完成上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞封裝；

一天之內(nèi)完成細(xì)胞懸液制備、單細(xì)胞捕獲、cDNA擴(kuò)增以及建庫(kù)；

捕獲效率高，單細(xì)胞捕獲效率高達(dá)65%；

應(yīng)用范圍廣，動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞均可以進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。

技術(shù)流程    

GEM形成后，細(xì)胞裂解，凝膠珠自動(dòng)溶解釋放大量barcode序列，隨后mRN逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生帶有Barcode和UMI標(biāo)記的cDNA。 

油滴破碎，cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行酶切、末端修復(fù)、加測(cè)序接頭P5及測(cè)序引物R2等傳統(tǒng)二代測(cè)序的建庫(kù)過(guò)程。 

測(cè)序后，得到每個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜。

數(shù)據(jù)分析

10x提供免費(fèi)的專(zhuān)業(yè)的數(shù)據(jù)分析軟件：    

Cell Ranger分析流程，是10x Genomics針對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開(kāi)發(fā)的完整分析流程，結(jié)合轉(zhuǎn)錄比對(duì)數(shù)據(jù)和標(biāo)示細(xì)胞的barcode信息，該流程能進(jìn)行細(xì)胞聚類(lèi)、差異基因篩選、差異基因功能分析。

Loupe Cell Browser 可視化分析

樣本準(zhǔn)備 

細(xì)胞類(lèi)型：生殖細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞、其他原代細(xì)胞等動(dòng)物細(xì)胞；植物細(xì)胞（提取原生質(zhì)體)。 

細(xì)胞狀態(tài)：細(xì)胞直徑<40μm（≥40μm時(shí)，需抽取細(xì)胞核）；細(xì)胞活性>90%；細(xì)胞濃度5×10⁵~1.2×10⁶/ml；雙細(xì)胞率低于5%；在制備細(xì)胞懸液時(shí)，緩沖液不含Ca²⁺和Mg²⁺。 

應(yīng)用領(lǐng)域

腫瘤（微環(huán)境、耐藥、免疫等）；細(xì)胞異質(zhì)性研究；新型細(xì)胞發(fā)現(xiàn)；發(fā)育及分化；免疫反應(yīng)；構(gòu)建細(xì)胞圖譜；定點(diǎn)編輯基因的細(xì)胞水平研究……

應(yīng)用方向

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